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技术专栏

细胞培养技术

不同细胞,其培养环境不同,我们需要不断地调整培养模式,从而达到最佳的细胞状态。

ES 细胞培养

原代胚胎成纤维细胞(ME)的制备

1.12.5-13.5dpc孕鼠,断颈处死;

2.将鼠腹面向上放置,70% 酒精润湿、消毒腹部(防止腹毛飞扬,污染内脏及子宫),剪开皮肤层、肌肉层,打开腹腔,将连接在子宫上的结缔组织及脂肪剪去,将子宫取出,转入无菌10cm平皿中;

3.把平皿转入超净台;

4.用镊子打开子宫壁,挤出鼠胚,并与胚外组织、胎盘等分离,除去鼠胚的头、四肢及各种内脏(主要为肝脏、肺脏、心脏和肠胃等);

5.将鼠胚移入另一新的无菌皿,用PBS洗三次;

6.弃去PBS,用弯头剪将鼠胚剪碎,加入PBS洗至溶液基本无色(14次);

7.加入适量Trypsin-EDTA0.25% Gibco 25520,下同),体积约等于组织块体积;

8.用滴管轻轻吹匀,室温下消化110分钟(或消化至溶液浑浊变粘),加入与消化液等体积培养基,轻轻吹打混匀(510次),静置;

9.沉降后将上部溶液轻轻吸出,转入离心管中。

10.将细胞悬液管离心(10005分钟);

11.弃去上清,向沉淀中加入适量培养基,轻轻吹打重悬,将其分种至10 cm细胞培养皿,补加适量培养基,作标签(ME0;注意:若冻存,则可以使用复苏后的0ME制作Feeder;若直接使用则最好不用0ME细胞做Feeder,要传到一代以后再用来制作Feeder比较好),转入培养箱培养;

12.视细胞生长情况换液(一般3天换液一次),若细胞已长满,则冻存,或者13-5传代(视细胞疏密而定),放入培养箱继续培养(此后不用再换液);15代的ME细胞均可用来制作Feeder

饲养层细胞(Feeder)的制备

注:含10 ug/ml丝裂霉素CDMEM血清培养基(FBS10%)(实验室所用MMC10 mg/mLCalbiochem

1.弃去细胞培养皿中的培养液,加入适量含10ug/ml丝裂霉素C的培养基(DMEM+10% FBS);

2.放入培养箱培养3小时(24小时);

3.0.1% 明胶处理培养皿(将明胶加入,摇动使明胶覆盖全部皿底,然后吸出明胶弃去即可),室温放置2小时以上,至皿底明胶干燥为止;

4.弃去含有丝裂霉素C的培养基,加入23 mL PBS,轻轻摇动,弃去PBS,如此洗3-5次(必须洗3次以上,以便彻底洗去残存的丝裂霉素,丝裂霉素是有丝分裂抑制剂,因而对ES细胞有毒性);

5.加入适量胰酶消化30秒,吸去消化液,静置至细胞层出现裂缝或明显滑壁为止,加入培养基,吹打,种至明胶处理过的培养皿中即可(如细胞过稀,可再补加丝裂霉素处理过的细胞),半小时后即可使用(如果急用,则可以用ES细胞培养基终止消化,然后与ES细胞一起转入明胶处理过的新板上),可使用610天,用前更换培养液(如未用明胶处理培养皿,则需在培养箱中放置2小时以上方可使用;最好是前一天下午制作Feeder,第二天上午使用,这时的Feeder状态最好,最适于ES细胞贴壁生长,而且万一制作的Feeder在第二天早上发现出了问题,还可以赶紧补做)。

ES细胞培养DMEM+15%FBS

2-巯基乙醇:  5.5uM     1000X     Gibco     21985-023

L-谷氨酰胺:   2mM      100X      Sigma     G8540

LIF: 1000U/mL 10000X   Chemicon   ESGRO? (LIF);   10E7 units,  货号:ESG1107

非必需氨基酸:100uM    100X      Gibco    11140-050

双抗: 100X    Gibco      15070-063

ES细胞的复苏细胞

1.提前制备好相应数量的Feeder

2.准备3739℃的热水,从液氮罐中取出所需冻存管(冻存细胞),迅速投入热水中,迅速剧烈摇动直至冻存液全部融化;

3.转入无菌间,1000/分钟离心5-10分钟;

4.弃上清,加入1 ml ES培养液轻轻吹打重悬,转入铺有饲养层细胞的培养皿中(冻存前细胞来自多大的培养皿,复苏时就用相应大小的培养皿),补加适量培养液;

5.转入培养箱培养,次日换液;此后每24小时换一次液,每48小时传一次代(视生长情况)。

ES细胞的换液

1.提前半小时左右将培养基从4℃冰箱取出,放于室温(或者放于37℃温箱内);

2.细胞培养皿从培养箱内取出,相差显微镜下作常规观察(判断生长情况,并确证未发生污染)后转入无菌操作台内;

3.ES细胞培养皿内的液体吸出、弃去,换新鲜培养基(6 cm培养皿约5 mL3.5 cm培养皿约3 mL培养基;若死细胞较多则可以先用PBS洗一次,再加培养基);

4.放回培养箱继续培养。

ES细胞的传代

1.前一天下午做好所需数量的Feeder细胞板;

2.提前半小时左右将培养基从4℃冰箱取出,放于室温(或者放于37℃温箱内);

3.ES细胞培养皿、Feeder细胞培养皿从培养箱内取出(相差显微镜下作常规观察,Feeder细胞应生长良好,细胞覆盖95%左右,至少90%以上的培养皿面积);ES细胞应生长良好,接近长满培养皿,细胞集落大小一致、疏密均匀,集落形状规则、呈椭圆形、边缘光滑、表面光滑,细胞生长致密、核大、胞质少;

4.ES细胞培养皿内的液体吸出、弃去,用PBS 1 mL左右洗一遍,加入胰蛋白酶溶液,作用约30秒,小心吸出胰蛋白酶溶液,弃去;再作用1?5分钟,不时观察,待细胞层(皿底一层白色脏东西样膜)出现裂缝并明显开始下滑时,补加培养基,适度吹打(视消化程度及管口粗细而定,至看不到明显的大的细胞团块为止);平均分到Feeder培养皿中(滴加,以免将Feeder细胞吹脱落下来),滴加补加培养基至5 ml左右(滴加,以免将Feeder细胞吹脱落下来;若为3.5cm培养皿,则补加至3ml左右),作好标签;

5.前后左右水平晃动培养皿,使ES细胞均匀分布于培养皿中,放入培养箱继续培养。

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